3 W (pat) Ep 7/23

ECLI:DE:BPatG:2025:280125U3Ni7.23EP.0 BUNDESPATENTGERICHT IM NAMEN DES VOLKES URTEIL 3 Ni 7/23 (EP) (Aktenzeichen) In der Patentnichtigkeitssache … - 2 - betreffend das europäische Patent EP 3 421 997 (DE 60 2013 070 076) hat der 3. Senat (Nichtigkeitssenat) des Bundespatentgerichts aufgrund der mündlichen Verhandlung vom 28. Januar 2025 durch den Vorsitzenden Richter Schramm, den Richter Dipl.-Chem. Dr. Freudenreich und die Richterinnen Dipl.- Chem. Dr. Wagner, Dr.-Ing. Philipps sowie Berner f ü r R e c h t e r k a n n t : I. Die Klage wird abgewiesen. II. Die Klägerin trägt die Kosten des Rechtsstreits. III. Das Urteil ist gegen Sicherheitsleistung in Höhe von 120 % des zu vollstreckenden Betrages vorläufig vollstreckbar. Tatbestand Die Beklagte ist Inhaberin des am 20. Dezember 2013 angemeldeten und auch mit Wirkung für die Bundesrepublik Deutschland erteilten europäischen Patents 3 421 997 (Streitpatents). Es nimmt die Prioritäten der US-Anmeldung 2012 61 746 965 vom 28. Dezember 2012 und der EP-Anmeldung 13167355 vom 10. Mai 2013 in Anspruch. Die Erteilung des in englischer Sprache gefassten Streitpatents ist am 17. Juni 2020 veröffentlicht worden. Es ist in Kraft und wird vom Deutschen Patent- und Markenamt unter dem Aktenzeichen 60 2013 070 076.1 geführt. Das Streitpatent trägt die Bezeichnung „A CELL MEDIATED IMMUNE RESPONSE ASSAY“ - 3 - in der deutschen Übersetzung: „ZELLVERMITTELTER IMMUNREAKTIONSTEST“. Es umfasst in seiner erteilten Fassung 22 Patentansprüche, von denen die Patentansprüche 1, 14, 16, 17, 19, 20 und 21 nebengeordnet sind. Der das Verfahren zur Messung zellvermittelter Immunantwortaktivität betreffende Patentanspruch 1 lautet in der erteilten Fassung: 1. A method for measuring cell-mediated immune response activity, said method comprising: (a) providing an incubation composition by contacting a sample comprising immune cells capable of producing immune effector molecules following stimulation by a peptide antigen with at least one peptide antigen having a length selected from 5 to 100 amino acids and with at least one non-reducing sugar capable of increasing the interferon-gamma response of immune cells that respond to the antigen; and (b) detecting the presence or level of at least one immune effector molecule, wherein detecting the presence or level of at least one immune effector molecule comprises detecting the presence or level of interferon-gamma (INF- gamma) and/or an immune effector molecule whose production is induced or enhanced by interferon-gamma. Der erteilte Patentanspruch 14 betrifft eine Zusammensetzung geeignet für das Verfahren nach Patentanspruch 1 und hat in der erteilten Fassung folgenden Wortlaut: 14. A composition for inducing a cell mediated immune response, comprising: a) at least one isolated peptide antigen having a length selected from 5 to 100 amino acids; - 4 - b) at least one non-reducing sugar capable of increasing the interferon-gamma response of immune cells that respond to the antigen; and c) at least one anticoagulant. Der Patentanspruch 16 in der erteilten Fassung betrifft ein Probensammelgefäß, das eine Zusammensetzung nach Patentanspruch 14 enthält; er lautet wie folgt: 16. A sample collection vessel, comprising the composition according to Claim 14 or 15. Der erteilte Patentanspruch 17 betrifft ein Kit geeignet für das Verfahren nach Patentanspruch 1 und hat folgende Fassung: 17. A kit for measuring cell-mediated immune response activity in a subject, comprising at least one peptide antigen having a length selected from 5 to 100 amino acids, preferably from 7 to 50 amino acids, at least one non-reducing sugar capable of increasing the interferon-gamma response of immune cells that respond to the antigen, at least one sample collection vessel and at least one detection means for interferon-gamma and/or an immune effector molecule whose production is induced or enhanced by interferon-gamma. Der erteilte Patentanspruch 19 betrifft die Verwendung eines nichtreduzierenden Zuckers in immunologischen Assay und lautet wie folgt: 19. Use of a non-reducing sugar in an immunological assay for measuring cell- mediated response activity to a peptide antigen having a length selected from 5 to 100 amino acids, preferably from 7 to 50 amino acids, wherein the addition of the non-reducing sugar increases the release of interferon-gamma from immune cells that respond to the peptide antigen tested in said assay, and wherein preferably, the non-reducing sugar has one or more of the following characteristics: - 5 - i) the non-reducing sugar is a disaccharide; ii) the non-reducing sugar is selected from trehalose and sucrose; iii) the non-reducing sugar is selected from trehalose, mannitol, sucrose and raffinose; iv) the non-reducing sugar is trehalose; v) the non-reducing sugar is used in a concentration of at least 1 mg/ml, preferably 2 mg/ml in the incubation composition comprising the sample to be tested and the antigen; vi) the non-reducing sugar is provided in the form of a composition which additionally comprises the antigen to be tested and optionally an anticoagulant; vii) the addition of the non-reducing sugar during incubation of the sample with the antigen increases the release of interferon-gamma from immune cells that respond to the peptide antigen tested in said assay. Der Patentanspruch 20 betrifft die Verwendung eines nichtreduzierenden Zuckers in einem immunologischen Assay, zur Erhöhung der Freisetzung von Interferon- gamma aus Immunzellen und lautet in der erteilten Fassung wie folgt: 20. Use of a non-reducing sugar in an immunological assay for measuring cell- mediated response activity for increasing the release of interferon-gamma from immune cells that respond to an antigen tested in said assay, optionally wherein the antigen and/or the non-reducing sugar have one or more of the characteristics defined in claim 15. Der erteilte Patentanspruch 21 betrifft ein Probensammelgefäß mit einer Inkubationszusammensetzung und lautet wie folgt: 21. An incubation composition comprised in a sample collection vessel, the incubation composition comprising: - 6 - a) a non-diluted sample obtained from a subject, the sample comprising immune cells capable of producing immune effector molecules following stimulation by a peptide antigen, preferably T lymphocytes; b) at least one isolated peptide antigen having a length selected from 5 to 100 amino acids; c) at least one non-reducing sugar capable of increasing the interferon-gamma response of immune cells that respond to the antigen; and d) optionally an anticoagulant. Die Patentansprüche 2 bis 13 sind unmittelbar oder mittelbar auf Patentanspruch 1, der Patentanspruch 15 auf Patentanspruch 14, der Patentanspruch 18 auf Patentanspruch 17 und der Patentanspruch 22 auf Patentanspruch 21 rückbezogen. Wegen ihres Wortlauts wird auf die Akte verwiesen. Die Klägerin begehrt mit ihrer Nichtigkeitsklage die vollständige Nichtigerklärung des Streitpatents und stützt diese zum einen auf mangelnde Patentfähigkeit mit Blick auf fehlende erfinderische Tätigkeit. Zum anderen sei der Gegenstand des Streitpatents nicht so deutlich und vollständig offenbart, dass ein Fachmann ihn ausführen könne. Die Klägerin beantragt, das europäische Patent 3 421 997 mit Wirkung für das Hoheitsgebiet der Bundesrepublik Deutschland für nichtig zu erklären. Die Beklagte beantragt, die Klage abzuweisen, hilfsweise die Klage mit der Maßgabe abzuweisen, dass das Streitpatent die Fassung eines der Hilfsanträge 1 bis 10 gemäß Schriftsatz vom 12. Oktober 2023 erhält. Wegen des Wortlauts der Patentansprüche nach den Hilfsanträgen 1 bis 10 wird auf die Akte verwiesen. - 7 - Die Beklagte tritt der Argumentation der Klägerin entgegen und ist der Auffassung, der Gegenstand des Streitpatents sei ausführbar offenbart und beruhe auch auf einer erfinderischen Tätigkeit. Beide Parteien haben zur Stützung ihres jeweiligen Vorbringens u.a. folgende Dokumente in das Verfahren eingeführt: K1 EP 3 421 997 B1 (Streitpatent); K3 WO 2004/042396 A1; K4 Präve, P., et al. (Hrsg.): Handbuch der Biotechnologie. 4. Auflage. Oldenbourg Verlag GmbH, München, 1994. S. 469- 476. – ISBN 3-486-26223-8; K5 Manning, M. C., et al., „Stability of Protein Pharmaceuticals: An Update”, Pharmaceutical Research, 2010, Vol. 27, No. 4, S. 544- 575; K6 Crowe, L. M., et al., “Is Trehalose Special for Preserving Dry Biomaterials?”, Biophysical Journal, 1996, Vol. 71, S. 2087- 2093; K8 Roser, B., “Trehalose Drying: A Novel Replacement for Freeze- Drying”, BioPharm, September 1991, S. 47-53; K9 US 4 806 343; K10 Carpenter, J. F., et al., “Rational Design of Stable Lyophilized Protein Formulations: Some Practical Advice”, Pharmaceutical Research, 1997, Vol. 14, No. 8, S. 969-975; K11 Li, S., et al., “Effects of Reducing Sugars on the Chemical Stability of Human Relaxin in the Lyophilized State”, Journal of Pharmaceutical Sciences, 1996, Vol. 85, No. 8, S. 873-877; K16 Sigma-Aldrich, „Storage and Handling Synthetic Peptides GUIDELINES“, 2005, S. 1-4; - 8 - K17 Maecker, H. T., et al., „Standardization of cytokine flow cytometry assays“, BMC Immunology, 2005, Vol. 6, No. 13, S 1-18; K18 Maecker, H. T., et al., „Standardizing Immunophenotyping for the Human Immunology Project“, Nature Reviews Immunology, 2012, Vol. 12, S. 191-200; K19 Inokuma, M., et al. „Functional T Cell Responses to Tumor Antigens in Breast Cancer Patients Have a Distinct Phenotype and Cytokine Signature“ The Journal of Immunology, 2007, Vol. 179, No. 4, S. 2627-2633; K20a Lima, V. M. F., et al., „Role of Trehalose Dimycolate in Recruitment of Cells and Modulation of Production of Cytokines and NO in Tuberculosis“, Infection and Immunity, 2001, Vol. 69, No. 9, S. 5305-5312; K20b Davidsen, J., et al., „Characterization of cationic liposomes based on dimethyldioctadecylammonium and synthetic cord factor from M. tuberculosis (trehalose 6, 6’-dibehenate) - A novel adjuvant inducing both strong CMI and antibody responses“, Biochimica et Biophysica Acta, 2005, Vol. 1718, S. 22-31; K20c Schoenen, H., et al., „Cutting Edge: Mincle Is Essential for Recognition and Adjuvanticity of the Mycobacterial Cord Factor and its Synthetic Analog Trehalose-Dibehenate“, The Journal of Immunology, 2010, Vol. 184, S. 2756-2760; K21a Matsuura, M., et al., „Biological Activities of Chemically Synthesized Partial Structure Analogues of Lipid A“, The Journal of Biochemistry, 1985, Vol. 98, No. 5, S. 1229-1237; K21b Matsuura, M., et al., „Effects of Backbone Structures and Stereospecificities of Lipid A - Subunit Analogues on Their Biological Activities“, The Journal of Biochemistry, 1986, Vol. 99, No. 5, S. 1377-1384; K22 Sarkar, S., et al., „Trehalose, a Novel mTOR-independent Autophagy Enhancer, Accelerates the Clearance of Mutant - 9 - Huntingtin and α-Synuclein“, The Journal of Biological Chemistry 2007, Vol. 282, No. 8, S. 5641-5652; K23 Chang, Y.-P., et al., „Autophagy Facilitates IFN-γ-induced Jak2- STAT1 Activation and Cellular Inflammation“, The Journal of Biological Chemistry 2010, Vol. 285, No. 37, S. 28715-28722; K24a Insel, P., et al., "Nutrition”, Jones and Bartlett Publishers, Inc., Sudbury, Massachusetts, 2. Aufl., 2004, S. 135. – ISBN 0-7637- 0765-1; K24b O’Donnell, K. und Kearsley, M. W., “Sweeteners and Sugar Alternatives in Food Technology“, Wiley-Blackwell, A John Wiley & Sons, Ltd., Chichester, Publication, 2. Aufl., 2012, S. 301; K24c Kamm, B., et al., „Biorefineries – Industrial Processes and Products. Status Quo and Future Directions.” WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim, 2006, Vol. 1, S. 5 und 376. – ISBN-13: 978-3-527-31027-2; K24d Stütz, A. E., „Glycoscience Epimerisation, Isomerisation and Rearrangement Reactions of Carbohydrates“, Springer Verlag, Berlin Heidelberg New York, 2001, Vorwort, S. 1. ISBN 3-540- 41383-9; K24e Fraser-Reid, B. O., et al., (Hrsg.), „Glycosience Chemistry and Chemical Biology“, Springer Verlag, Berlin Heidelberg New York, 2. Aufl., 2008, S. 1193. ISBN 978-3-540-30429-6; K25 Amorij, J.-P., et al., „Development of Stable Influenza Vaccine Powder Formulations: Challenges and Possibilities“, Pharmaceutical Research, 2008, Vol. 25, No. 6, S. 1256-1273; K30-2 Hauer, B., et al., „Interferon-γ-Tests in der Tuberkulose- Diagnostik - Aktueller Stand“, Pneumologie, 2006, Vol. 60, S. 29- 44; K30-3 QuantiFERON®-TB Gold, IFN-Gamma-Test für Vollblutproben zur Messung von Reaktionen auf die Peptidantigene ESAT-6, - 10 - CFP-10 und TB7.7(p.4), Packungsbeilage, cellestis, Dok.-Nr. 05990301G, Juli 2011, S. 1-31; K31 BIONOTE, Versuchsbericht E-HTB-VS vom 8. Mai 2024, 6 Seiten; K32 BIONOTE, ergänzender Versuchsbericht TCF-E-HTB-VS vom 23. Dezember 2024, 9 Seiten; K33 Statistische Auswertung der Versuchsdaten gemäß Anlage K32, 24. Januar 2025, 5 Seiten; NiB2 Falbe, J. und Regitz, M. (Hrsg.): Römpp-Lexikon Chemie. Georg Thieme Verlag, Stuttgart, 10. Aufl., 1999, Band 6, S. 5096-5097, Eintrag „Zucker“. – ISBN 3-13-735110-3; NiB3 Voet, D. und Voet, J. G., „Biochemistry“, John Wiley & Sons, Inc., 2. Aufl., 1995. S. 252-253. – ISBN 0-471-58651-X; NiB4 Dorland’s Illustrated Medical Dictionary, 2000, Eintrag „simple s.“; NiB6 Accelerated stability study, undatiert, 2 Seiten; NiB15 X … , zweite Sachverständigenerklärung vom 3. Juni 2024, 10 Seiten. Entscheidungsgründe Die zulässige Klage hat in der Sache keinen Erfolg, da die geltend gemachten Nichtigkeitsgründe der mangelnden Patentfähigkeit und der mangelnden Ausführbarkeit nicht vorliegen (Art. II § 6 Abs. 1 Nr. 1 und Nr. 2 IntPatÜG, Art. 138 Abs. 1 Buchst. a) EPÜ i. V. m. Art. 52, 54, 56 EPÜ, Art. 138 Abs. 1 Buchst. b) EPÜ). I. - 11 - 1. Das Streitpatent betrifft Verfahren, Zusammensetzungen und Kits zur Messung zellvermittelter Immunantwortaktivität mit erhöhter Sensitivität und verbesserter Lagerstabilität (vgl. K1, [0001]). Diagnostische Tests auf immunologischer Basis finden im medizinischen Bereich breite Anwendung. Sie sind insbesondere wichtige Hilfsmittel für die Erkennung und Überwachung einer Vielzahl von Krankheiten. Die Wirksamkeit dieser Assays liegt zum Teil in der Spezifität von Komponenten des Immunsystems wie T- Lymphozyten. Ungeachtet dieser Spezifität ist die immunologische Diagnostik nicht immer ausreichend empfindlich, um schwach ausgeprägte Infektionen, das Vorhandensein einer dauerhaften Infektion, das Vorhandensein einer dauerhaften, schwach ausgeprägten Infektion, Infektionen bei Personen mit aktiven oder latenten infektiösen oder latenten Infektionskrankheiten oder bei Personen mit Immunschwäche oder irgendeiner Form von Immunsuppression nachzuweisen. Zu den wünschenswerten Leistungsmerkmalen eines Assays für zellvermittelte Immunreaktionen, insbesondere zum Nachweis einer antigenspezifischen T-Zell- Reaktion, gehören eine angemessene Sensitivität, Spezifität, Zuverlässigkeit und Reproduzierbarkeit, wobei er einfach und schnell durchführbar sein sollte (vgl. K1, [0002]). Eine etablierte Form eines immunologisch basierten diagnostischen Tests beinhaltet die Stimulation von T-Zellen oder anderen Zellen des Immunsystems mit Antigenen, gefolgt vom Nachweis von Immuneffektor-Molekülen wie IFN-gamma oder anderer Zytokine, die als Reaktion auf die Stimulation mit dem Antigen produziert werden. Die Immuneffektor-Moleküle werden mit bekannten Techniken wie Enzym-Immunoassays, Multiplex-Bead-Analyse, ELISA, ELISpot und Durchflusszytometrie nachgewiesen. Das Vorhandensein oder die Zunahme von Immuneffektor-Molekülen kann auch anhand des RNA-Levels bestimmt werden. Solche Assays sind z. B. nützlich für den Nachweis krankheitsspezifischer Immunreaktionen, insbesondere pathogenspezifischer Immunreaktionen. Entsprechende Assays sind unter der Marke QuantiFERON (eingetragenes Warenzeichen; Cellestis Limited, vgl. auch K30-3) im Handel erhältlich und können - 12 - z. B. zur Diagnose einer Erregerinfektion oder zur Überwachung der zellvermittelten Immunität gegen eine Krankheit verwendet werden (vgl. K1, [0003]). Andere Anwendungen solcher zellvermittelten Immunreaktionstests umfassen die Analyse oder Überwachung von zellulären Immunreaktionen auf Impfstoffe oder Immuntherapien, wie z.B. die Krebsimmuntherapie (vgl. K1, [0004]). Es bestand daher ein großer Bedarf an entsprechenden Assays mit erhöhter Empfindlichkeit. Bisher wurden die Methoden zur Messung zellvermittelten Immunreaktionen dadurch verbessert, dass die Probe, z. B. eine Vollblutprobe, mit dem Antigen in Gegenwart eines einfachen Zuckers wie Dextrose inkubiert wurde (siehe z. B. K3). Es wurde festgestellt, dass Einfachzucker, wie Dextrose, die auch als Glucose bezeichnet wird, die Produktion von Interferon-gamma durch die Immunzellen erhöhen und dadurch die Empfindlichkeit des Assays verbessern. Die Verwendung von Einfachzuckern wurde als essentiell erachtet, da sie den Zellen als Energiequelle dienen, sodass diese während der Inkubation mit dem Antigen von der Zugabe des Zuckers profitieren. Ein signifikanter Anstieg des Interferon- gamma-Spiegels wurde beobachtet, wenn der Einfachzucker direkt zur Probe zusätzlich zum Antigen zugegeben wurde. Um die Durchführung der Methode zu vereinfachen, ist es jedoch vorzuziehen, gebrauchsfertige Reagenzien- Zusammensetzungen bereitzustellen und manuelle Handhabungsschritte zu vermeiden (vgl. K1, [0005]). 2. Davon ausgehend lag dem Streitpatent die Aufgabe zugrunde, ein sensitives und zuverlässiges Verfahren zur Messung zellvermittelter Immunantwortaktivität, sowie Kits und Kitkomponenten dafür bereitzustellen, die lagerstabil sind (vgl. K1, [0015]). 3. Die Aufgabe wird gemäß Hauptantrag in Form des Streitpatents in der erteilten Fassung durch ein Verfahren zur Messung zellvermittelter Immunantwortaktivität gemäß Patentanspruch 1, eine Zusammensetzung zur Induktion einer zellvermittelten Immunantwort gemäß Patentanspruch 14, ein Probensammelgefäß gemäß Patentanspruch 16, ein Kit gemäß Patentanspruch 17, - 13 - die Verwendung eines nichtreduzierenden Zuckers in einem immunologischen Assay zur Messung zellvermittelter Antwortaktivität gemäß den Patentansprüchen 19 und 20 sowie eine in einem Probengefäß enthaltende Inkubationszusammensetzung gemäß Patentanspruch 21 gelöst. a) Der erteilte Patentanspruch 1 gemäß Hauptantrag lautet nach Merkmalen gegliedert wie folgt: 1 Ein Verfahren zur Messung zellvermittelter Immunantwortaktivität, das Verfahren umfassend: 1.1 Bereitstellen einer Inkubationszusammensetzung durch in Kontakt bringen einer Probe, die Immunzellen aufweist, die imstande sind nach vorheriger Stimulation durch ein Peptidantigen lmmuneffektor Moleküle zu produzieren, 1.1.1 mit wenigstens einem Peptidantigen, das eine Länge ausgewählt aus von 5 bis 100 Aminosäuren aufweist und 1.1.2 mit wenigstens einem nichtreduzierenden Zucker, der imstande ist die Interferon-gamma Antwort von lmmunzellen zu steigern, die auf das Antigen reagieren; und 1.2 Detektion der Anwesenheit oder des Spiegels von wenigstens einem lmmuneffektor Molekül, wobei 1.2.1 die Detektion der Anwesenheit oder des Spiegels von wenigstens einem lmmuneffektor Molekül die Detektion der Anwesenheit oder des Spiegels von Interferon-gamma (IFN- gamma) und/oder von einem lmmuneffektor Molekül, dessen Produktion durch Interferon-gamma induziert oder verstärkt wird, umfasst. - 14 - b) Der erteilte Patentanspruch 14 gemäß Hauptantrag betrifft eine Zusammensetzung und lautet nach Merkmalen gegliedert wie folgt: 14 Eine Zusammensetzung zur Induktion einer zellvermittelten Immunantwort, aufweisend: 14.1 wenigstens ein isoliertes Peptidantigen, das eine Länge ausgewählt aus von 5 bis 100 Aminosäuren aufweist; 14.2 wenigstens einen nichtreduzierenden Zucker, der imstande ist die Interferon-gamma Antwort von Immunzellen zu steigern, die auf das Antigen reagieren; und 14.3 wenigstens ein Antikoagulans. c) Der erteilte Patentanspruch 16 gemäß Hauptantrag betrifft ein Probensammelgefäß, das eine Zusammensetzung nach Patentanspruch 14 bzw. 15 enthält und lautet nach Merkmalen gegliedert wie folgt: 16 Ein Probensammelgefäß, aufweisend die Zusammensetzung gemäß Merkmalsgruppe 14 oder Anspruch 15. d) Der erteilte Patentanspruch 17 gemäß Hauptantrag betrifft ein Kit und lautet nach Merkmalen gegliedert wie folgt: 17 Ein Kit zur Messung zellvermittelter Immunantwortaktivität in einem Subjekt, aufweisend 17.1 wenigstens ein Peptidantigen mit einer Länge ausgewählt aus von 5 bis 100 Aminosäuren, vorzugsweise von 7 bis 50 Aminosäuren, - 15 - 17.2 wenigstens einen nichtreduzierenden Zucker, der imstande ist die Interferon-gamma Antwort von Immunzellen zu steigern, die auf das Antigen reagieren, 17.3 wenigstens ein Probensammelgefäß und 17.4 wenigstens ein Mittel zur Detektion von Interferon-gamma und/oder von einem Immuneffektor Molekül, dessen Produktion durch Interferon-gamma induziert oder verstärkt wird. e) Der erteilte Patentanspruch 19 gemäß Hauptantrag betrifft die Verwendung eines nichtreduzierenden Zuckers in einem immunologischen Assay und lautet nach Merkmalen gegliedert wie folgt: 19 Verwendung eines nichtreduzierenden Zuckers in einem immunologischen Assay zur Messung zellvermittelter Antwortaktivität 19.1 auf ein Peptidantigen, das eine Länge ausgewählt aus von 5 bis 100 Aminosäuren aufweist, vorzugsweise von 7 bis 50 Aminosäuren, 19.2 wobei das Hinzufügen des nichtreduzierenden Zuckers die Freisetzung von Interferon-gamma aus lmmunzellen erhöht, die auf das in dem Assay getesteten Peptidantigen reagieren, und 19.3 wobei der nichtreduzierende Zucker vorzugsweise eine oder mehrere der folgenden Eigenschaften aufweist: 19.3.1 der nichtreduzierende Zucker ist ein Disaccharid; 19.3.2 der nichtreduzierende Zucker ist ausgewählt aus Trehalose und Saccharose; 19.3.3 der nichtreduzierende Zucker ist ausgewählt aus Trehalose, Mannitol, Saccharose und Raffinose; - 16 - 19.3.4 der nichtreduzierende Zucker ist Trehalose; 19.3.5 der nichtreduzierende Zucker wird in einer Konzentration von mindestens 1 mg/ml, vorzugsweise 2 mg/ml, in der Inkuba- tionszusammensetzung eingesetzt, die die zu testende Probe und das Antigen aufweist; 19.3.6 der nichtreduzierende Zucker wird bereitgestellt in Form einer Zusammensetzung, die zusätzlich das zu testende Antigen und optional ein Antikoagulans aufweist; 19.3.7 das Hinzufügen des nichtreduzierenden Zuckers während Inkubation der Probe mit dem Antigen erhöht die Freisetzung von Interferon-gamma aus Immunzellen, die auf das in dem Assay getestete Peptidantigen reagieren. f) Der erteilte Patentanspruch 20 gemäß Hauptantrag betrifft die Verwendung eines nichtreduzierenden Zuckers in einem immunologischen Assay zur Erhöhung der Freisetzung von Interferon-gamma aus Immunzellen und lautet nach Merkmalen gegliedert wie folgt: 20 Verwendung eines nichtreduzierenden Zuckers in einem immunologischen Assay zur Messung zellvermittelter Antwortaktivität 20.1 zur Erhöhung der Freisetzung von Interferon-gamma aus lmmunzellen, die auf ein in dem Assay getestetes Antigen reagieren, wobei 20.2 optional das Antigen und/oder der nichtreduzierende Zucker eine oder mehrere der in Anspruch 15 definierten Eigenschaften aufweisen. - 17 - g) Der erteilte Patentanspruch 21 gemäß Hauptantrag betrifft ein Probensammelgefäß mit einer Inkubationszusammensetzung und lautet nach Merkmalen gegliedert wie folgt: 21 Eine in einem Probensammelgefäß enthaltene Inkubations- zusammensetzung, die Inkubationszusammensetzung umfassend: 21.1 eine unverdünnte, von einem Subjekt erhaltene Probe, die Probe umfassend Immunzellen, die imstande sind nach vorheriger Stimulation durch ein Peptidantigen Immuneffektor Moleküle zu produzieren, vorzugsweise T-Lymphozyten; 21.2 wenigstens ein isoliertes Peptidantigen mit einer aus 5 bis 100 Aminosäuren ausgewählten Länge; 21.3 wenigstens einen nichtreduzierenden Zucker, der imstande ist die Interferon-gamma Antwort von lmmunzellen zu steigern, die auf das Antigen reagieren; und 21.4 optional ein Antikoagulans. 4. Einige Merkmale der unabhängigen Patentansprüche bedürfen der Auslegung. Der zuständige Fachmann, ein promovierter Biochemiker oder Immunologe, der über eine mehrjährige praktische Erfahrung in der Entwicklung sowie Herstellung von diagnostischen, immunologischen Testverfahren (Immunoassays) verfügt, wird sie wie folgt verstehen: a) Die Besonderheit des Verfahrens nach Patentanspruch 1 liegt darin, dass in die Inkubationszusammensetzung neben dem Peptidantigen (Merkmal 1.1.1) ein nichtreduzierender Zucker gegeben wird, der imstande ist, die Interferon-gamma Antwort der Immunzellen zu steigern, die auf das Peptidantigen reagieren (Merkmal 1.1.2). - 18 - Die übrigen, auf verschiedene Gegenstände (Zusammensetzung, Probensammelgefäß, Kit, Verwendung) gerichteten, unabhängigen Patentansprüche haben mit dem Patentanspruch 1 als gemeinsame Klammer, dass ein Peptidantigen zusammen mit einem nichtreduzierenden Zucker verwendet wird, um die Interferon-gamma Antwort der Immunzellen zu steigern, die auf das Peptidantigen reagieren (Merkmale 1.1.1, 1.1.2 // 14.1, 14.2 // 17.1, 17.2 // 19, 19.1 // 20, 20.1 // 21.2, 21.3). b) Das in der Inkubationszusammensetzung verwendete Antigen wird gemäß den Merkmalen 1.1.1, 14.1, 17.1, 19.1 und 21.2 immer als (isoliertes) Peptidantigen mit einer aus 5 bis 100 Aminosäuren ausgewählten Länge spezifiziert (vgl. K1, [0041], Z. 33-34). Insoweit handelt es sich auch bei dem in Merkmal 1.1.2 genannten „Antigen“ um dieses Peptidantigen. Das Merkmal 20.1 definiert hingegen ein Antigen im Allgemeinen, das nach streitpatentgemäßem Verständnis neben Peptiden auch Proteine, Haptene, Allergene und Toxine sowie alle natürlich oder synthetisch vorkommenden Moleküle oder Teile davon umfasst, ohne dass diese auf eine Länge eingeschränkt sind (vgl. K1, [0041], Z. 33-34). Generell kann das Antigen als Peptidset vorliegen, das zwei oder mehr verschiedene überlappende bzw. nichtüberlappende Volllängen- oder Teillängen- Peptide umfasst (vgl. K1, [0041], Z. 43-45). c) Das Streitpatent unterscheidet zwischen Peptiden und Proteinen (vgl. K1, [0041], Z. 40-41), auch wenn diese Unterscheidung nicht trennscharf getroffen werden kann (vgl. K11: Relaxin mit 53 Aminosäuren wird als Protein bezeichnet). d) Als nichtreduzierende Zucker werden Zucker bezeichnet, die nicht mit einem Reagenz zum Nachweis von Zuckern reagieren. Beispiele dieser – Oxidationsmittel enthaltenden – Reagenzien sind die Fehlingsche Lösung, Benedicts Reagenz oder Tollens Reagenz (vgl. K1, [0047], Satz 2), welche bewirken, dass reduzierende Zucker oxidiert werden. Ein nichtreduzierender Zucker hat kein freies reduzierendes Molekülende und daher keine freie Aldehyd- oder Ketogruppe. Einschränkungen - 19 - hinsichtlich Länge oder Aufbau erfährt der nichtreduzierende Zucker nicht (vgl. K1, [0047], S. 8, Z. 1-3). Bevorzugt sind als nichtreduzierende Zucker auch Disaccharide genannt, bei denen die reduzierenden Enden eines Monosaccharids miteinander eine sogenannte glykosidische Bindung eingehen. Beispiele dafür sind Sucrose (= Saccharose; „Haushaltszucker“) und Trehalose. Mannitol und Raffinose sind ebenfalls geeignete Beispiele eines nichtreduzierenden Zuckeralkohols bzw. eines nichtreduzierenden Trisaccharids (vgl. K1, [0047], S. 8, Z. 12-16). Der nichtreduzierende Zucker hat bei der vorliegenden Erfindung die Funktion, die Sensitivität des Immunoassays zu erhöhen, indem er von den anwesenden Zellen als Energielieferant metabolisiert wird (vgl. K1, S. 8, Z. 26-27) und so zu einer Erhöhung der Immuneffektor-Ausschüttung durch die Zelle führt (vgl. K1, [0055], Z. 35-38 und 46-48). Entgegen der Annahme der Klägerin dient er nicht als Stabilisator für das Antigen (vgl. K1, [0055], Z. 43-44). e) Das Streitpatent verwendet den Begriff einfacher Zucker (simple sugar) zur Unterscheidung von streitpatentgemäßen nichtreduzierenden Zuckern gemäß Merkmal 1.1.2. Als Beispiel einfacher Zucker wird Dextrose (Glucose) genannt (vgl. K1, [0005], [0019], Z. 35-43). Unter einem simple sugar ist sowohl nach streitpatentgemäßem als auch fachmännischem Verständnis ein reduzierender Einfachzucker (Monosaccharid), zu verstehen (vgl. K1 [0019], Z. 35-39, insb. Z. 38, „simple sugars and thus monosaccharides“). Der Einfachzucker unterscheidet sich, wie ausgeführt, von dem streitpatentgemäßen nichtreduzierenden Zucker durch dessen reduzierende Endgruppe (vgl. K1, [0047], insbesondere S. 8, Z. 10-20; vgl. auch NiB3, S. 252, li. Sp., Abs. 3, Satz 1; NiB4 re Sp., Stichwort „simple s[ugar], a monosaccharide“). - 20 - f) Darüber hinaus ist die Anwesenheit eines reduzierenden Zuckers, wie Glucose, als weiteres Additiv im Einklang mit den Erläuterungen in Absatz [0050] der K1 bei dem beanspruchten Verfahren nach Patentanspruch 1 und den weiteren Gegenständen der nebengeordneten Patentansprüche nicht ausgeschlossen, sondern nur als nicht bevorzugt ausgewiesen (K1, [0050] Z. 5-7). Ein ausdrücklicher Hinweis auf die mögliche Kombination eines reduzierenden und eines nichtreduzierenden Zuckers findet sich in K1 jedenfalls nicht. g) Schließlich ist noch der Begriff „Inkubationszusammensetzung“ einheitlich dahingehend zu verstehen, dass es sich hierbei um eine Mischung aus der zu analysierenden Probe, mindestens einem Antigen und mindestens einem nicht- reduzierenden Zucker handelt (vgl. K1, [0040] und [0048]). II. Der Gegenstand des Streitpatents ist ausführbar offenbart. 1. Für die Ausführbarkeit einer Lehre reicht es aus, wenn der Durchschnittsfachmann auf Grund der in der Patentschrift enthaltenen Informationen in der Lage ist, unter Inanspruchnahme des von ihm zu erwartenden Informations- und Wissensstandes und des allgemeinen Fachwissens und mit Hilfe der in der Patentschrift aufgezeigten Ausführungswege die in der Patentschrift beschriebene Lehre zum technischen Handeln zuverlässig, wiederholbar und ohne unzumutbarem Aufwand in die Praxis umzusetzen (BGH, Urt. v. 18. Dezember 2020 – X ZR 15/19, GRUR-RS 2020, 42976 Rn. 44 – L-Aminosäureproduktion; BGH, Urt. v. 25. Februar 2010 - Xa ZR 100/05, GRUR 2010, 414 Rn. 23 - Thermoplastische Zusammensetzung; Urt. v. 13. Juli 2010 - Xa ZR 126/07, GRUR 2010, 916 (918) – Klammernahtgerät; BGH, Urt. v. 17. Januar 2017, X ZR 11/15, GRUR 2017, 493 Rn. 36 – Borrelioseassay). Der beste Weg zur Ausführung muss dabei nicht - 21 - offenbart sein (BGH, a.a.O. Rn. 35 – Borrelioseassay). Ob die der Erfindung in der Beschreibung zugeschriebenen Vorteile erreichbar sind, spielt für die Ausführbarkeit keine Rolle (BGH, Urt. v. 3. Februar 2015, X ZR 76/13, GRUR 2015, 472 Rn. 36 – Stabilisierung der Wasserqualität; BGH, Beschl. v. 28.04.1999 - X ZB 12/98, GRUR 1999, 920, 922 – Flächenschleifmaschine). Zudem muss der Patentanspruch auch nicht alle zur Ausführung erforderlichen Angaben enthalten (BGH, Beschl. v. 11. September 2013 – X ZB 8/12, GRUR 2013, 1210 Rn. 20 – Dipeptidyl-Peptidase-Inhibitoren; BGH, Urt. v. 1. Oktober 2002 – X ZR 112/99, GRUR 2003, 223 – Kupplungsvorrichtung II; BGH, Urt. v. 24. März 1998, X ZR 39/95, GRUR 1998, 1003 Rn. 47 – Leuchtstoff; BGH, Urt. v. 13. Juli 2010, Xa ZR 126/07, GRUR 2010, 916 Rn. 17 – Klammernahtgerät). Nach diesen Grundsätzen ist die Lehre des Streitpatents ausführbar offenbart. Denn das Streitpatent gibt ausreichend Beispiele der Stoffklasse „nichtreduzierender Zucker“ an, die dem Fachmann mit der Funktionsangabe „nichtreduzierend“ die entscheidende Richtung angeben, um mögliche geeignete Zucker auswählen zu können. Dabei ist es unerheblich, dass darunter auch Verbindungen, wie Mannitol, Sucrose oder Raffinose fallen (vgl. K1, Fig. 3 i.V.m. [0165]), die gegenüber der einen besonders ausgeprägten Effekt zeigenden Trehalose einen geringen Effekt zeigen. Denn entgegen der zum Zeitpunkt der Erfindung laut Streitpatent vorherrschenden Meinung, dass nur „einfache Zucker“ (Einfachzucker) die Interferon-gamma Antwort von Immunzellen steigern könnten (vgl. K1 [0019], Z. 35-39), lehrt das Streitpatent dem Fachmann, dass auch andere Zucker geeignet sind und nennt hierzu auch praktisch brauchbare Beispiele (vgl. K1, [0153]-[0165]). 2. Entgegen der Auffassung der Klägerin kommt es auch nicht darauf an, dass die Interferon-gamma Antwort von der Konzentration des jeweiligen nichtreduzierenden Zuckers abhängt und niedrige Konzentrationen unter 2 mg/ml bei Trehalose einen nur geringeren Effekt bewirken. Denn bereits 1 mg/l Trehalose erzeugt statistisch gesehen einen – wenn auch geringen – Effekt (vgl. K1, Fig. 1 i.V.m. [0160], [0161]), der insoweit die Brauchbarkeit der Erfindung nachweist. Nach Beispiel 1 tritt selbst bei einer Konzentration von 0,5 mg/l Trehalose eine - 22 - Sensitivitätssteigerung auf (vgl. K1, [0153], Z. 7-8 i.V.m. Z. 11). Dass eine geeignete Menge an nichtreduzierendem Zucker je nach konkret verwendetem Zucker ermittelt werden muss, stellt den Fachmann keinesfalls vor unzumutbare Schwierigkeiten. 3. Das Argument der Klägerin, wonach die Erhöhung der IFN-gamma Freisetzung aus den Immunzellen durch den Einsatz des nicht-reduzierenden Zuckers unter Hinweis auf die Daten des Streitpatents und die Versuche gemäß NiB6, K31 und K32 sowie die Erklärung NiB15 in Verbindung mit der statistischen Berechnung K33 nicht über die gesamte Anspruchsbreite erzielbar sei, überzeugt nicht. a) Aus den Ergebnissen der Versuchsreihen gemäß NiB6 kann nicht abgeleitet werden, dass Trehalose die Freisetzung von Interferon-gamma nicht erhöht. Denn die Resultate der jeweiligen Versuchsreihe gemäß NiB6 können nicht miteinander verglichen werden, da innerhalb der Versuchsreihe die jeweilige Immunantwort in Bezug auf den Reihen-internen Kontrollansatz normiert wurde (vgl. NiB6, S. 2, vorletzt. Abs.). Der NiB6 kann damit nur die Information entnommen werden, dass auch nach neun Wochen nahezu kein Sensitivitätsverlust auftrat, wenn eine Antigen-enthaltende Zusammensetzung mit Trehalose einer beschleunigten Alterung durch Lagerung bei 55°C unterworfen wurde (vgl. NiB6, S. 1, dritter Abs., S. 2, Diagramme links), bzw. dass Antigene, die ohne Trehalose gelagert wurden, lagerstabil sind (vgl. NiB6, S. 1, 3. Abs., S. 2, Diagramme rechts). b) Bei den Versuchen gemäß K31 wurden ausgehend von den gemessenen optischen Dichten OD keine Interferon-gamma-Konzentrationen in IU/ml ermittelt (vgl. K31, S. 5, Diagramm „Comparison according to trehalose conditions“). Laut K32 sind aber Werte von 10 IU/ml oder mehr von der Ergebnisinterpretation auszunehmen, da Signalunterschiede nicht feststellbar sind (vgl. K32, S. 5, 4)). Nachdem der OD-Wert der Probe „Positive 5“ mit 3,3 mehr als zehnmal so hoch ist wie die OD-Werte der Proben „Positive 2 bis 4“ (vgl. K31, S. 5, letzte Tabelle), - 23 - bestehen erhebliche Zweifel an der Richtigkeit der Ergebnisinterpretation der K31; zumal in K31 keine Angaben zu einem solchen „cut off“ gemacht werden. Darüber hinaus unterscheiden sich die Bedingungen der Teströhrchen der Fallgruppen 1 und 2 der Versuche gemäß K31 darin, dass die Röhrchen der Fallgruppe 1, welche keine Trehalose enthielten, nicht sterilisiert wurden (vgl. K31, S. 4, Abs. „2) Conditions for test Tube“). Diese abweichenden Versuchsbedingungen stellen einen weiteren Grund dar, warum die Ergebnisse der Fallgruppen 1 und 2 nicht verglichen werden können, zumal laut K32 Signalabweichungen zwischen gamma-bestrahlten und nicht-bestrahlten Proben feststellbar sind (vgl. K32, S. 5, Nr. 5, 1) letzt. Satz i.V.m. S. 5 Tabelle). Der Versuchsbericht K31 lässt damit nicht die Schlussfolgerung zu, dass die Anwesenheit von Trehalose nicht zu einer Sensitivitätssteigerung führt. c) Entgegen der Auffassung der Klägerin kann auch aus den Versuchsergebnissen der K32 nicht geschlossen werden, dass Trehalose nicht im Stande ist, die Interferon-gamma Antwort der Immunzellen zu steigern, die auf das Antigen reagieren. Die Ergebnisse der 20 positiven Proben, die jeweils in zwei Versuchsreihen mit und ohne Trehalose in STANDARD E TB-FERON Röhrchen inkubiert wurden (vgl. K32, S. 1, Nr. 1, 1) Purpose), wobei in der ersten Versuchsreihe eine gamma-Sterilisation und in der zweiten Versuchsreihe keine Sterilisation durchgeführt wurde (vgl. K32, S. 3, 6) und S. 4, Nr. 5 „Test Results“), zeigen zwar, wie die Klägerin anführt, dass unabhängig von der Sterilisation bei 11 der insgesamt 40 durchgeführten Tests der beiden Versuchsreihen keine Signalsteigerung bei Anwesenheit von Trehalose gemessen wurde. Damit ist aber bei 73 % der durchgeführten Tests eine Sensitivitätssteigerung durch die Anwesenheit von Trehalose aufgetreten (vgl. K32, S. 5, Tabelle). Nach dieser Betrachtung ergibt sich kein Hinweis darauf, dass der beanspruchte Effekt, eine Sensitivitätssteigerung durch Trehalose, sich nicht im beanspruchten Bereich einstellt. - 24 - Die weitere Berücksichtigung der statistischen Auswertung K33, die die Ergebnisse der jeweiligen Versuchsreihe der K32 mit dem Wilcoxon-Test prüft, führt zu keiner abweichenden Einschätzung. Das Argument der Klägerin, wonach K33 zufolge unabhängig von der Sterilisation aufgrund der p-Werte von 0,2493 (gamma- Sterilisation) und 0,0519 (keine gamma-Sterilisation) kein signifikanter Unterschied zwischen den Ergebnissen mit oder ohne Trehalose festgestellt werden könne, da diese Werte größer 0,05 seien (vgl. K33, S. 2, Nr. 4 Ergebnis) und die Zugabe von Trehalose keinen Effekt auf die Interferon-gamma Ausschüttung im Assay habe (vgl. K33, S. 2, Nr. 5 Schlussfolgerung, Abs. 1), überzeugt nicht. Denn dies steht im Widerspruch zu den Ergebnissen gemäß Beispiel 4 des Streitpatents und der klinischen Studie NiB15. Bei der Versuchsreihe gemäß Beispiel 4 des Streitpatent wurden 20 MTP-positive Blutproben mit dem QuantiFERON (QFN)-Assay getestet (vgl. K1, S. 25, Z. 14 bis 29 i.V.m. Fig. 2). Die Blutsammelröhrchen enthielten die synthetischen Antigene ESAT-6 und CFP-10 sowie Trehalose bzw. keine Trehalose, wobei keine gamma-Sterilisation angegeben ist. Die Ergebnisse der Versuchsreihe wurden mit dem t-Test ausgewertet, welcher den signifikanten p- Wert von 0,0005 ergab. Im Rahmen der klinischen Studie NiB15, die von Dezember 2013 bis Mai 2014 stattfand, wurden in QFT-Plus Antigenblutsammelröhrchen zwei verschiedene Zusammensetzungen bereitgestellt. Jede Zusammensetzung enthielt neben einem TB1- oder T2-Peptidantigen, Lithiumheparin sowie Trehalose oder keine Trehalose. Diese Zusammensetzungen wurden mit 30 TB-positiven Blutproben auf eine Steigerung der Interferon-gamma Antwort getestet. Die Ergebnisse der Untersuchung wurden mit dem Wilcoxon-Test ausgewertet und ergaben jeweils für die untersuchten Antigene ein p-Wert von kleiner 0,0001 (vgl. NiB15, Nr. 43-47). Die statistische Auswertung der Versuchsreihen ohne Sterilisation gemäß K32 und Beispiel 4 des Streitpatents sowie NiB15 zeigen ausgezeichnete p-Werte von 0,0519 für K32 und 0,0005 für Beispiel 4 des Streitpatent sowie <0,0001 für NiB15. Daher kann nur mit einer Wahrscheinlichkeit von 5 % (K32), 0,05 % (Beispiel 4 des Streitpatents) bzw. kleiner 0,01% (NiB15) davon ausgegangen werden, dass nach - 25 - den beobachteten Ergebnissen keine Sensitivitätssteigerung festgestellt werden konnte, aber nicht ausgeschlossen werden, dass es sich um Zufallsbefunde handelt. Das Ergebnis der Versuchsreihe mit der gamma-Sterilisation gemäß K32, welche einen p-Wert von 0,2493 lieferte, also 25 % an Zufallsbefunden, ist bereits schon deshalb nicht als Beweis dafür geeignet, dass Trehalose grundsätzlich keinen Einfluss auf Reaktivität des eingesetzten Peptidantigens hat, weil entgegen der Lehre des Streitpatents eine gamma-Sterilisation vorgenommen wurde. Selbst unter der Annahme, dass eine gamma-Sterilisation einer naheliegenden Abwandlung gleichkommt, lässt der Vergleich der p-Werte der Versuchsreihen gemäß K32 allein den Schluss zu, dass die gamma-Bestrahlung die Zusammensetzung schädigt, da die Reaktivität des Peptidantigens bei der Versuchsreihe mit gamma-Sterilisation gegenüber der ohne gamma-Sterilisation geringer war. Die von der Klägerin vorgelegten Versuche gemäß K32 und die statistischen Berechnungen gemäß K33 lassen damit nicht zweifelsfrei die Schlussfolgerung zu, dass die Erhöhung der IFN-gamma Freisetzung aus den Immunzellen durch den Einsatz des nicht-reduzierenden Zuckers nicht über die gesamte Anspruchsbreite erzielbar ist. d) Auch der Verweis auf die Entscheidung G1/03 der Großen Beschwerdekammer des Europäischen Patentamts führt zu keiner anderen Einschätzung, weil die Entscheidung im Einklang mit der etablierten Rechtsprechung des BGH steht (vgl. Große Beschwerdekammer EPA, Entsch. v. 8. April 2004, G01/03, Nr. 2.5.2; BGH Urt. v. 26. Januar 2021, X ZR 24/19, GRUR 2021, S. 696, Rn. 99 – Phytase), welche, wie schon ausgeführt wurde, gerade nicht fordert, dass jede erdenkliche Ausführungsform, die theoretisch unter einen Anspruch fällt, ausführbar sein muss. - 26 - III. In der erteilten Fassung beruht der Gegenstand des Streitpatents gegenüber dem geltend gemachten Stand der Technik auf einer erfinderischen Tätigkeit. 1. Der Gegenstand des Patentanspruchs 1 in der erteilten Fassung beruht auf einer erfinderischen Tätigkeit. a) Auf die von der Klägerin vertretene Auffassung, wonach Merkmal 1.2.2 keinen technischen Effekt gegenüber dem nächstliegenden Stand der Technik habe, weshalb die Verwendung von nichtreduzierenden Zuckern eine willkürliche Abwandlung darstelle, kommt es bei der Beurteilung der erfinderischen Tätigkeit nicht an. Die Patentfähigkeit einer Erfindung hängt nach der ständigen Rechtsprechung des BGH und des BPatG nicht vom technischen Effekt dieser Erfindung gegenüber den Stand der Technik ab, sondern allein davon, ob die Merkmale ihrer Lehre ausgehend vom Stand der Technik nahelagen. Ein technischer Effekt ist dabei allenfalls eines von vielen Hilfskriterien bei der Beurteilung der erfinderischen Tätigkeit, wobei das bloße Vorliegen eines technischen Effekts gegenüber dem bekannten Stand der Technik die erfinderische Tätigkeit genauso so wenig zu begründen vermag (vgl. BGH, Urt. v. 10. Dezember 2002 - X ZR 68/99, GRUR 2003, 317, 320 f. – Kosmetisches Sonnenschutzmittel; BGH, Urt. v. 10. September 2009 - Xa ZR 130/07, GRUR 2010, 123 Rn. 41 – Escitalopram; BGH, Urt. v. 11. November 2014 – X ZR 128/09, GRUR 2015, 356 Rn. 44 – Repaglinid), wie umgekehrt aus seinem bloßen Fehlen gegenüber dem Stand der Technik auf deren Verneinung geschlossen werden darf. Ungeachtet dessen zeigt das Streitpatent auch einen technischen Effekt. Die technischen Wirkungen der Verwendung eines nicht-reduzierenden Zuckers im dem patentgemäßen Verfahren zur Messung einer zellvermittelten Immunantwort zeigen sich darin, dass eine Erhöhung der Assay-Sensitivität erzielt wird (vgl. K1, S. 24/25, Beispiele 3 bis 5 i.V.m. Fig. 1 bis 3), wobei zugleich der Nachteil eines - 27 - Sensitivitätsverlusts nach längerer Lagerung und der damit einhergehende Verlust der Reproduzierbarkeit vermieden wird (vgl. K1, S. 24, Beispiel 2, Tab. 1). Die von der Klägerin vorgelegten Vergleichsversuche K31 und K32 können aus den oben dargelegten Gründen die vorteilhaften erfinderischen Effekte von Trehalose, nämlich die Erhöhung der Assaysensitivität und eine Verbesserung der Lagerstabilität, nicht in Frage stellen. b) Das Verfahren gemäß dem erteilten Patentanspruch 1 ergibt sich nicht in naheliegender Weise aus einer Zusammenschau der Druckschrift K3 in Verbindung mit der Druckschrift K11. aa) Druckschrift K3, der sich ein Fachmann zuwendet, der vor die streitpatentgemäße Aufgabe gestellt ist, ein sensitives und zuverlässiges Verfahren zur Messung zellvermittelter Immunantwortaktivität, sowie Kits und Kitkomponenten dafür bereitzustellen, die lagerstabil sind, lehrt ein Verfahren zur Messung einer zellvermittelten Immunantwort entsprechend Merkmal 1. Das Verfahren umfasst das Bereitstellen einer Probe von einem Subjekt, die Zellen von dessen Immunsystems enthält, welche nach Stimulation durch ein Antigen in der Lage sind, Immuneffektormoleküle zu produzieren. Diese Probe wird entsprechend dem Bereitstellen einer Inkubationszusammensetzung nach Merkmal 1.1 mit dem Antigen inkubiert (vgl. K3, Patentanspruch 1). Als Antigen sieht K3 ein Peptidantigen vor (vgl. K3, Patentansprüche 21, 27 bis 30), einschließlich eines Tuberkulose (TB)-spezifischen Antigens, das mit dem ESAT-6 Peptid (K3, Patentanspruch 28 und S. 38, Z. 3-6), CFP-10 (K3, Patentanspruch 29 und S. 38, Z. 3-6) oder TB7 (K3, Patentanspruch 30) überlappt. Darüber hinaus kann nach Patentanspruch 31 der K3 das TB-spezifische Peptidantigen PPD von Mycobacterium avium oder ein 25-mer Abschnitt des TB7.7 Peptids sein (K3, S. 38, Z. 3-6). Das ESAT-6-Protein hat unbestritten in voller Länge eine Länge von 95 Aminosäuren, das CFP-10-Protein in voller Länge eine Länge von 100 Aminosäuren und das TB7.7-Protein in voller Länge eine Länge von 81 Aminosäuren, wobei sein - 28 - 25-Aminosäure-Teil natürlich eine Länge von 25 Aminosäuren aufweist. Somit haben die in K3 genutzten Peptidantigene eine Länge von bis zu 100 Aminosäuren, wie in Merkmal 1.1.1 gefordert. Das Verfahren gemäß Patentanspruch 1 der K3 sieht auch die Messung des Vorhandenseins oder der Erhöhung des Spiegels eines Immuneffektormoleküls vor, bei dem es sich um ein Zytokin wie Interferon-gamma handelt (vgl. K3, Patentansprüche 1, 9 und 10). Somit werden in K3 auch Merkmal 1.2 und die erste Option von Merkmal 1.2.1 angegeben. Die Inkubation geschieht gemäß K3 in Gegenwart eines „simple sugar“ (vgl. K3 Patentanspruch 19, S. 3, Z. 15; S. 4, Z. 12; S. 10, Z. 20-21), welcher beispielsweise Dextrose (Glucose) ist (vgl. K3, Patentanspruch 20, S. 37, Z. 20-21 i.V.m. S. 38, Z. 4-6). Bei dem Begriff „simple sugar“ handelt es sich, was gutachtlich NiB2 und NiB3 bereits dargelegt wurde, nicht um einen feststehenden Fachbegriff. Ebenso wie im Streitpatent ist dieser Begriff auch in K3 anhand der dort gegebenen Information auszulegen. Es findet sich aber nur die weitergehende Information, dass ein „simple sugar“ beispielsweise Dextrose (Glucose) und damit ein reduzierender Zucker ist. Aus diesen Angaben schließt der Fachmann, dass es sich hierbei um ein Monosaccharid handelt, trifft aber keine weitere Differenzierung etwa hinsichtlich reduzierender Eigenschaften. Die Berücksichtigung der von der Klägerin eingereichten K6 und des Anlagenkonvoluts K24a bis K24e vermag diese Einschätzung nicht zu ändern. Zwar fallen unter den Begriff „simple sugar“ in den genannten Dokumenten sowohl Mono- wie Disaccharide (vgl. K6, S. 2087, Abstract, erster Satz, li. Sp., erster Abs.; K24a, S. 135, Überschrift des zweiten Abs.; K24b, S. 301, Abs. „13.5.5 Laxative effects“ Z. 6-7; K24c, S. 5, Tabellenüberschrift i.V.m. den Einträgen 1 bis 8 der Tab. 1.1; K24d, Abs. „Preface“ Z. 1-10; K24e, S. 1193, Abs. „3 Galacto-Oligosaccharides“ Z. 1-6). Maßgeblich bleibt aber nur der sich aus der K3 ergebende Begriffsinhalt, welcher dem Begriff „simple sugar“ die Bedeutung eines Monosaccharids zuweist. - 29 - Damit unterscheidet sich das Verfahren gemäß dem erteilten Patentanspruch 1 von dem in K3 offenbarten Verfahren darin, dass es die Anwesenheit eines nichtreduzierenden Zuckers in der Inkubationszusammensetzung vorschlägt, der imstande ist, die Interferon-gamma Antwort von Immunzellen und die Lagerstabilität der Inkubationszusammensetzung zu steigern, wobei der nichtreduzierende Zucker nicht als Stabilisator dient (vgl. K3, [0055]). Ausgehend von dem Inhalt der Druckschrift K3, die kein Verfahren mit Merkmal 1.1.2 angibt, bestand für den Fachmann schon kein Anlass, die Offenbarung der Druckschrift K11 zu berücksichtigen, die den Einfluss von reduzierenden Zuckern auf die chemische Stabilität von humanen Relaxin im lyophilisierten Zustand untersucht (vgl. K11, S. 873, Titel und Abstract). Denn die K3 befasst sich weder mit der Frage, wie ein Mehrkomponenten-Kit bzw. dessen Komponenten zu stabilisieren sind, noch spricht sie die Möglichkeit der Lyophilisierung als einen Weg der Trocknung für irgendeine in dem Verfahren eingesetzte Komponente an. Überdies schweigt K3 dazu, dass es gerade auf eine schonende Behandlung der Antigene ankommen könnte. Im Gegenteil stellt K3 heraus, dass Fragmente der Antigene ebenfalls ihre Funktion erfüllen (vgl. K3, S. 14, Z. 10, 14-15 und 27-28), sodass der Erhalt des kompletten Antigens nicht erforderlich ist. In K11 wird zwar festgestellt, dass Glucose im Gegensatz zu Mannitol und Trehalose die Degradation des Peptids Relaxin, das 53 Aminosäuren entsprechend Merkmal 1.1.1 aufweist (vgl. K11, S. 873, Fig. 1), im gefriergetrockneten Zustand verstärkt (vgl. K11 S. 874, Tab. 2). Allerdings ist Relaxin bei Lagerung im flüssigen Zustand, auch in hochkonzentrierten Glucose-Lösungen mit 10 % bzw. 20 % Glucose, bei 40°C für 2 Wochen hinreichend stabil (vgl. K11, S. 875/876 seitenübergr. Satz, Fig. 6). Diese Ergebnisse veranlassen den Fachmann somit nicht dazu, die aufwändige Trocknungsmethode des Lyophilisierens aus K11 für die Antigene der K3 in Betracht zu ziehen, sondern an einer Glucose-Lösung festzuhalten. Da die - 30 - Konzentration der in den Ausführungsbeispielen der K3 verwendeten Glukose- Lösung nur 2 % beträgt, und unter der Annahme eines etwa linearen Abbautrends (vgl. K11, S. 876, Fig. 6), hätte der Fachmann mit Blick auf Figur 6 der K11 für eine solche Lösung einen Abbau um 1 % erwartet, welcher für eine hinreichend stabile flüssige Formulierung mit Glucose spricht. Vor dem Hintergrund, dass bei dem Verfahren zur Messung einer zellvermittelten Immunantwortaktivität gemäß K3 Glucose maßgeblich für die Sensitivität des Verfahrens ist, da sie die Interferon-gamma Antwort der Immunzellen steigert und die K11 dem Fachmann nicht in Aussicht stellt, dass die Verwendung eines nicht- reduzierenden Zuckers zu mindestens einer gleichen Sensitivitätssteigerung führt, bestand somit keine hinreichende Erfolgsaussicht, diesen Weg einzuschlagen. Damit überzeugt auch der klägerseitige Angriff nicht, dass ausgehend von der bevorzugten „in-Tube“ Ausführungsform der K3, bei der die Blutprobe in Anwesenheit des Antigens in einem heparinisierten Blutsammelröhrchen und in Gegenwart von Glucose inkubiert wird, und dem Wissen, dass die getrockneten Peptidantigene des kommerziell angebotenen „QuantiFERON®-TB Gold In-Tube“ Test gemäß K30-2 nur 15 Monate haltbar sind, der Fachmann aufgrund seines Fachwissens veranlasst gewesen sei, für die Bereitstellung einer stabilen getrockneten „in-Tube“ Formulierung des Antigens den reduzierenden Zucker zu vermeiden und daher die Glucose, wie in K11, durch Trehalose zu ersetzen. Diese Argumentationskette stützt sich im Kern darauf, dass der Fachmann für eine trockene Formulierung der Zusammensetzung zur Induktion einer zellvermittelten Immunantwort eine Lyophilisierung der Peptidantigene in Betracht gezogen und Trehalose als Hilfsstoff der Glucose vorgezogen hätte. Dies ist aber aus den zuvor genannten Gründen nicht der Fall. bb) Eine fehlende erfinderische Tätigkeit lässt sich auch die weitere Berücksichtigung der K4, K5, K8 bis K10 oder K25 jeweils anstelle von K11 nicht begründen. - 31 - Sämtliche Dokumente befassen sich, wie K11, mit der Stabilisierung von Proteinen bzw. Peptiden sowie Vakzinen während der Gefriertrocknung durch die Anwesenheit von insbesondere nicht-reduzierenden Zuckern, wie beispielsweise Trehalose (vgl. K4, S. 472, re. Sp., Abs. „Formulierung“; K5, S. 544, re. Sp., Abs. „Chemical Instability“, insb. erster Satz; S. 546, re. Sp., Abs. „Deamidation in Monoclonal Antibodies (MAbs), zweiter Abs. davon, S. 546/547, übergr. Abs., S. 547 Abs. „Deamidation in the Solid State, S. 550, re. Sp., „Glycation of Proteins“, S. 550/551 seitenübergr. Abs., S. 551, Abs. „Oxidation“, dritter Abs. davon, S. 553, Abs. „Physical Instability“, S. 559, spaltenübergr. Abs., re. Sp. zweiter vollst. Abs., S. 559/569 seitenübergr. Abs., S. 560, erster vollst. Abs.; K8, S. 47, Abstract, S. 48, re. Sp., „Potential Savings“, S. 51, li. Sp., erster vollst. Abs., S. 47, mittl. Sp., erster Abs., S. 52, li. Sp., erster vollst. Abs.; K9, Sp. 1, erster Abs., Sp. 1 Z. 45 bis 48, Sp. 3, Z. 65 bis 68; K10, S. 969, Titel, S. 972, re. Sp., letzt. vollst. Abs.; K25, S. 1256 Abstract, S. 1261, re. Sp., erster vollst. Abs., S. 1264, re. Sp., Abs. „Freeze Drying and Spray-Freeze Drying of Influenza Vaccine“). Nachdem der Fachmann aber ausgehend von K3 keine Motivation hatte, die Peptidantigene zu lyophilisieren, lag das streitpatentgemäße Verfahren gemäß dem erteilten Patentanspruch 1 unter Berücksichtigung von K5, K8 bis K10 oder K25 nicht nahe. Entgegen der Auffassung der Klägerin kann auch der Druckschrift K10 nicht entnommen werden, dass reduzierende Zucker generell und unabhängig von der Lyophilisierung bei der Formulierung von Peptiden zu vermeiden seien (vgl. K10, S. 972, vorletzt. Abs.). Im Übrigen wird in K25 nicht angegeben, dass es für den Erhalt der Primärstruktur des Vakzins auf die Anwesenheit eines Stabilisators bei der Trocknung ankommt. In K25 wird vielmehr darauf hingewiesen, dass Kohlenhydrate, insbesondere Trehalose, dessen dreidimensionale Struktur stabilisieren (vgl. K25, S. 1261, re. Sp., erster vollst. Abs., vorletzt. Satz, S. 1262, re. Sp., zweiter vollst. Abs., S. 1265, re Sp., dritter und vierter vollst. Abs.). - 32 - b) Auch eine Zusammenschau der K3 mit dem Inhalt einer der Druckschriften K16 bis K23 führt nicht in naheliegender Weise zu dem Gegenstand des erteilen Patentanspruchs 1. Die Dokumente K16 bis K19 sind von der Klägerin zum Beleg, dass eine Lyophilisierung zur Stabilisierung von Peptiden oder Antigenen, insbesondere auch bei deren Verwendung in Diagnostik-Verfahren, zum Prioritätszeitpunkt des Streitpatents eingesetzt wurde (vgl. K16, S. 2, zweiter und dritter Abs., S. 4, letzt. Abs.; K17 S. 12, li. Sp., erster vollst. Abs., S. 16, li. Sp., letzt. vollst. Abs., re. Sp, dritter vollst. Abs.; vgl. K18, S. 192, re. Sp., letzt. Abs., S. 193, Tab. 1, erster Eintrag, S. 196/19,7 seitenübergr. Abs.; K19 S. 2628, re. Sp., vorletzt. Abs.), eingeführt worden. Ob die Lyophilisierung in Gegenwart eines Zuckers erfolgte, kann den Druckschriften K16 bis K19 aber nicht entnommen werden. Nachdem für den Fachmann, ausgehend von K3 weder Anlass bestand, eine Lyophilisierung oder einen Austausch von Glucose gegen einen nicht-reduzierenden Zucker in Erwägung zu ziehen, führt die Berücksichtigung einer der Druckschriften K16 bis K19 nicht naheliegender Weise zum beanspruchten Verfahren. Auch die weitere Berücksichtigung von K20a, K20b oder K20c regt den Fachmann nicht dazu an, beispielsweise Trehalose zur Sensitivitätssteigerung bei dem Testverfahren nach Patentanspruch 1 einzusetzen. In K20a wird die Rolle des Glykolipids Trehalose-Dimycolate (TDM) bei der Interferon-gamma-Produktion in Mycobacterium tuberulosis diskutiert (vgl. K20a, S. 5305, Titel, Abstract, S. 5310, li. Sp., erster vollst. Abs.). Die K20b befasst sich mit dem synthetischen Analogon Trehalose-6,6‘-dibehenate (TBD) von TDM, das die Interferon-gamma Ausschüttung in CD4 T-Zellen stimuliert (vgl. K20b, S. 22, Titel, Abstract, S. 23, li. Sp., erster vollst. Abs.). In K20c wird die adjuvante Wirkung von TDM und TDB bei Th1/Th17-Tuberkulose-Impfungen untersucht (vgl. K20c, S. 2756, Titel und Abstract). Aus den Angaben in K20a bis K20c schließt der Fachmann aber nicht, dass die Glykolipide TDM und TBD in den Immunzellen zu Trehalose metabolisiert werden, welche dann als Energielieferant die Interferon-gamma Ausschüttung der Immunzellen stimuliert. Dieser Information hätte es aber bedurft, damit der - 33 - Fachmann Trehalose anstelle von Glucose für die Sensitivitätssteigerung bei dem streitpatentgemäßen Verfahren in Betracht gezogen hätte. Dies gilt gleichermaßen für die in den Publikationen K21a und K21b beschriebenen Ergebnisse der untersuchten Wirkung von verschiedenen Lipid A-Analoga, d.h. Glykolipiden auf Basis von nicht-reduzierenden Zuckern, auf die Interferon-gamma Ausschüttung (vgl. K21a, S. 1229, Titel und Abstract, S. 1230 und 1233; vgl. K21b, S. 1377, Titel und Abstract, S. 1379, Fig. 1, S. 1381, re. Sp.). Die in K21a und K21b dargestellten Ergebnisse lassen wiederum nicht den Schluss zu, dass der nicht- reduzierende Zuckerbestandteil des Glykolipids die Interferon-gamma Ausschüttung anregt. Der Fachmann geht vielmehr davon aus, dass dies auf die Anwesenheit der intakten Lipid A-Analoga zurückzuführen ist. Den Druckschriften K22 und K23 kann der Fachmann schließlich nur die Information entnehmen, dass gemäß K22 Trehalose als Autophagieverstärker angesehen wird (vgl. K22, S. 5621, Titel und Abstract) und dass K23 eine Verbindung zwischen Autophagie und Interferon-gamma-Ausschüttung sowie Zellentzündung sieht (vgl. K23, S. 28715, Abstract, S. 28716, re. Sp., S. 28720, re. Sp., Mitte). Dass die Interferon-gamma Ausschüttung von Immunzellen auf Autophagie beruht und daher Trehalose als Autophagieverstärker zu einer höheren Interferon-gamma Ausschüttung führt, ist aber aus K22 und K23 nicht ableitbar. c) Die weiteren von der Klägerin in das Verfahren eingeführten Druckschriften liegen noch ferner ab, sind nicht von der Klägerin in der mündlichen Verhandlung aufgegriffen worden und auch im Übrigen nicht zu berücksichtigen (vgl. BGH, Urt. v. 27. August 2013 – X ZR 19/12, GRUR 2013, 1272 Rn. 36 – Tretkurbeleinheit). 2. Die nebengeordneten Patentansprüche 14, 16, 17 und 19 bis 21 beruhen ebenfalls auf einer erfinderischen Tätigkeit. Sie zeichnen sich jeweils durch die technischen Merkmale von Patentanspruch 1 aus, insbesondere, dass ein nichtreduzierender Zucker vorgesehen ist, der in der Lage ist, die Interferon-gamma Antwort der Immunzellen zu steigern, die auf ein Peptidantigen reagieren (Merkmale 14.2, 17.2, 19.2, 20.1 und 21.3). - 34 - Das Argument der Klägerin, die beanspruchte Verwendung eines nichtreduzierenden Zuckers zur Steigerung der Interferon-gamma Antwort der Immunzellen gemäß den Patentansprüchen 19 und 20 sei kein neues Merkmal, sondern folge inhärent aus der naheliegenden Zugabe von Trehalose zur Stabilisierung des Peptidantigens, überzeugt nicht. Denn ein Verwendungsanspruch setzt nach der Rechtsprechung des BGH den zweckgerichteten Einsatz des jeweiligen Gegenstandes voraus. Bei der Beurteilung des Naheliegens einer zweckgerichteten Verwendung ist nur danach zu fragen, ob für diese Verwendung als Lösung des der Erfindung zugrundeliegenden Problems eine hinreichend konkrete Anregung im Stand der Technik gegeben war (vgl. BGH X ZR 99/14, Urt. v. 23. Februar 2017, GRUR 2017, 681 – Cryptosporidium). Vorliegend lag, wie ausgeführt wurde, weder nahe, einen nicht-reduzierenden Zucker in einem immunologischen Assay zur Messung zellvermittelter Antwortaktivität zur Erhöhung der Interferon-gamma Freisetzung einzusetzen, noch war der Fachmann veranlasst, ausgehend von K3 das Peptidantigen mit einem nicht-reduzierenden Zucker durch Lyophilisierung zu stabilisieren. Auch der Einwand, dass die Freisetzung von Interferon-gamma durch die Immunzellen mittelbar durch die stabilisierende Wirkung des nicht-reduzierenden Zuckers auf das Peptidantigen während der Lagerung erhöht werde, greift damit nicht. Im Übrigen tritt unabhängig von der Lagerung allein aufgrund der Zugabe eines nicht-reduzierenden Zuckers eine Erhöhung der Freisetzung von Interferon- gamma durch die Immunzellen ein (vgl. K1 [0153], [0154] und [0165]). 3. Die mittelbar oder unmittelbar auf den Patentanspruch 1 rückbezogenen Patentansprüche 2 bis 13, der auf Patentanspruch 14 rückbezogene Patentanspruch 15, der auf Patentanspruch 17 rückbezogene Patentanspruch 18 sowie der auf Patentanspruch 21 rückbezogene Patentanspruch 22 werden jeweils von den Nebenansprüchen getragen. - 35 - IV. Die Kostenentscheidung beruht auf § 84 Abs. 2 PatG i. V. m. § 91 Abs. 1 S. 1 ZPO. Die Entscheidung über die vorläufige Vollstreckbarkeit folgt aus § 99 Abs. 1 PatG i. V. m. § 709 S. 1 und S. 2 ZPO. Rechtsmittelbelehrung Gegen dieses Urteil ist das Rechtsmittel der Berufung gemäß § 110 PatG gegeben. Die Berufung ist innerhalb eines Monats nach Zustellung des in vollständiger Form abgefassten Urteils, spätestens aber innerhalb eines Monats nach Ablauf von fünf Monaten nach Verkündung, durch einen in der Bundesrepublik Deutschland zugelassenen Rechtsanwalt oder Patentanwalt als Bevollmächtigten schriftlich bzw. in elektronischer Form beim Bundesgerichtshof, Herrenstraße 45 a, 76133 Karlsruhe, einzulegen. Schramm Dr. Freudenreich Dr. Wagner Dr. Philipps Berner - 36 - Bundespatentgericht 3 Ni 7/23 (EP) (Aktenzeichen) Verkündet am 28. Januar 2025 … Justizbeschäftigte als Urkundsbeamtin der Geschäftsstelle